傷口愈合是一個復雜而動態(tài)的過程。當傷口表面的細菌群落被自產的細胞外聚合物進一步包裹時，就會形成一個新的生態(tài)系統(tǒng)，即生物膜。生物膜成熟引起的細菌毒力和致病性增強，是造成傷口愈合困難的重要因素。鎵 （Ga） 是一種通常用作臨床診斷和化療劑的 IIIA 族金屬，Ga離子可以運輸到細菌細胞中，最終導致細菌死亡。山東大學陳靜研究員等提出了一種用于治療感染傷口的超分子水凝膠敷料，該敷料由小分子葛根素和生物大分子絲素蛋白的雙重自組裝產生，并通過希夫堿鍵合將Ga離子摻入水凝膠基質中，使水凝膠具有優(yōu)異的止血和抗菌性能。
研究內容
將含有Ga離子、SF和葛根素的渾濁溶液加熱并攪拌至完全溶解。冷卻后形成白色不透明水凝膠。葛根素、葛根素-SF和葛根素-SF-Ga水凝膠分別命名為Px、PxFy和PxFyGaz，其中x、y和z分別是葛根素、SF和Ga離子的濃度。TEM成像中觀察到具有納米纖維狀網絡結構的葛根素-SF-Ga水凝膠。FTIR和XRD證實了SF與葛根素在凝膠化過程中的相互作用以及二級結構的轉變。Ga離子在促進SF無規(guī)卷曲向β片構象轉化方面具有促進作用。
圖1 水凝膠的制造和表征
利用透射電鏡（TEM）拍攝了水凝膠的微觀形貌，揭示了雙納米纖維共組裝形成水凝膠的動態(tài)過程。加熱的P1F1溶液滴在支撐膜上后，SF在葛根素納米纖維的外圍仍以球形結構存在，但其體積比單獨使用SF的體積大得多，表明發(fā)生了聚集。然而，當Ga離子和SF一起加熱時，圓形膠束發(fā)生變形，梭形SF小分子重新排列形成棒狀結構，進一步組裝形成納米纖維。加熱后，P1F1Ga0.05的SF和葛根素之間形成了交織的雙納米纖維結構。
圖2 電荷誘導SF納米纖維的形成機理
使用旋轉流變法驗證了雙納米纖維水凝膠的力學性能和熱穩(wěn)定性。0.01–1%應變范圍是水凝膠的線性粘彈性區(qū)域。添加Ga離子后，水凝膠的屈服應變點為7.05%。Ga離子可以誘導交聯(lián)密度的增加，從而大大提高了水凝膠的機械強度。隨著應變值的變化，水凝膠在凝膠態(tài)和溶膠態(tài)之間呈現交替過渡，當凝膠狀態(tài)恢復時，G′和G“與開始時相同，表明水凝膠具有自愈能力。水凝膠的黏度隨著剪切速率的增加而降低，表明水凝膠存在剪切稀化性能和可注射潛力。
圖3 水凝膠的流變學表征
研究了葛根素在體外不同時間從超分子水凝膠中累積釋放。Ga誘導SF發(fā)生構象變化，與葛根素納米纖維交織形成更穩(wěn)定的雙網狀結構，從而增加了延長釋放時間，P3F1Ga0.1在26 h時釋放率達到50%。3種凝膠在72 h的最終釋放率均超過95%，證明了藥物自組裝水凝膠基質具有高負載量和高釋放量的優(yōu)勢。
P3F1的溶血率相當低，表明水凝膠中的SF改善了葛根素的溶血，使其可以安全地用于傷口治療。隨著Ga陽離子的添加，溶血率略有增加，但仍保持在<5%，處于生物材料溶血的臨界安全范圍內。葛根素和SF均具有優(yōu)異的生物相容性，共培養(yǎng)后細胞活力與對照組無顯著差異。
有效的抗氧化劑可以維持細胞內氧化還原平衡，這對感染傷口的修復具有重要意義。所有含葛根素的水凝膠均表現出優(yōu)異的自由基清除活性和ROS清除能力，表明水凝膠優(yōu)異的抗氧化性能可用作理想的抗菌敷料。
圖4 水凝膠的體外釋放、生物相容性和抗氧化效率
Ga獨特的Fe模擬特性使其能夠通過競爭與細菌細胞內的Fe載體結合來抑制細菌維持生命的活動，從而導致細菌死亡。Ga離子對大腸桿菌的殺菌能力略高于金黃色葡萄球菌的殺菌能力。當Ga離子濃度超過0.025%時，水凝膠對兩種細菌的殺菌率均接近100%，實現了接近100%的抗生物膜效果。當Ga離子濃度為>0.05%時，P3F1Ga水凝膠表現出與慶大霉素（陽性對照）相似的顯著殺菌率和抗生物膜活性，表明其作為一種新型抗菌敷料可以作為促進感染傷口愈合的新型抗生素替代品。
圖5 水凝膠對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的體外抗菌活性
使用小鼠肝出血模型來模擬傷口急性出血的過程。將未治療的小鼠和接受商業(yè)止血敷料治療的小鼠分別設置為空白對照組和陽性對照組。與空白組的失血量為113.3 mg相比，P3F1Ga0.05水凝膠表現出快速止血，總失血量僅為13.3 mg。P3F1也表現出一些促止血特性，并具有與陽性對照組相似的止血作用，這可能歸因于水凝膠本身的物理屏障效應。P3F1Ga0.05中的Ga離子通過激活體內內源性凝血途徑來實現止血。因此，超分子納米纖維水凝膠在物理屏障和Ga離子的雙重作用下實現了傷口的快速止血，這對于傷口愈合的第一階段具有重要意義。
圖6 水凝膠的止血性能
選擇P3F1Ga0.05來評價水凝膠體內對小鼠全層金黃色葡萄球菌感染傷口模型的治療效果。建立小鼠感染模型，分別用Tegaderm（空白對照），P3，P3F1，P3F1Ga0.05和Aquacel Ag（商業(yè)敷料）治療。處理10 天后，P3F1Ga0.05處理的小鼠傷口完全閉合，Tegaderm組、P3組、P3F1組和Aquacel Ag組的閉合率分別為71.4%、83.2%、90%和95.7%；P3F1Ga0.05 和 Aquacel Ag 組傷口中的細菌菌落明顯較少，這表明P3F1Ga0.05水凝膠在傷口修復方面比市售的含Ag抗菌敷料更好。P3F1Ga0.05組中發(fā)現最小的疤痕面積，表明其在應用于傷口時在恢復皮膚原始功能和形態(tài)方面的重要性。
圖7 P3F1Ga0.05 水凝膠可加速金黃色葡萄球菌感染的傷口愈合
第3天在P3F1組中觀察到明顯的新表皮延伸，這主要歸因于SF對細胞的增殖和募集作用。肉芽組織的形成是隨后組織重塑和愈合的基礎，這促進了傷口的快速修復。第6天各組傷口區(qū)域均形成肉芽組織，且P3F1Ga0.05組的肉芽組織最厚、最致密。在傷口愈合的后期階段， P3F1Ga0.05組的再上皮化程度最大，表皮厚度最低，最接近正常組織。
圖8 組織學評估水凝膠對感染傷口的治療效果
在第 10 天分別對每組進行促炎標志物 TNF-α 和抗炎標志物 IL-4 的免疫熒光染色。空白對照組TNF-α因子（紅色）的高表達表明，由嚴重細菌感染引起的傷口炎癥持續(xù)時間延長，使傷口愈合困難。P3F1Ga0.05水凝膠組表現出最低的TNF-α表達率。IL-4綠色熒光在P3F1Ga0.1水凝膠組中的高表達表明，傷口在第10天已經退出炎癥期并進入增殖期，證明了P3F1Ga0.1水凝膠在促進感染傷口愈合方面具有出色的治療和免疫調節(jié)活性。
圖9 水凝膠的抗炎特性
結論
成功制備了一種具有雙納米原纖維結構的超分子水凝膠抗菌敷料，用于治療慢性感染傷口。帶正電荷的抗菌Ga離子誘導SF膠束重排，SF與葛根素組裝形成雙納米纖維結構，有效增強了所得超分子水凝膠的機械強度和熱穩(wěn)定性。葛根素的天然抗氧化特性可緩解由過量ROS引起的氧化應激，并促進感染傷口從炎癥期向增殖期的過渡。此外，SF賦予水凝膠優(yōu)異的生物相容性，并改善了單獨使用葛根素引起的溶血反應。制備的水凝膠具有高效的抗菌和傷口修復性能。因此，這種雙納米纖維超分子水凝膠作為一種新型抗感染敷料具有很強的競爭力，為感染傷口的治療提供了一種新的策略。
通訊作者簡介
陳靜，山東大學研究員，博士生導師。組建組織器官修復與再生生物材料課題組，主要研究方向為含糖水凝膠在骨科創(chuàng)面、骨軟骨缺損、脊柱脊髓損傷等臨床疾病治療領域的應用。主持國家自然科學基金等產學研項目20余項，在Chem. Soc. Rev等重要學術期刊上發(fā)表論文61篇。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1002/adhm.202400071
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